Hifectin II 真核转染试剂 C1505
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
C1505 | Hifectin II 真核转染试剂 | 0.25ml | 450元 |
C1505 | Hifectin II 真核转染试剂 | 0.5ml | 750元 |
C1505 | Hifectin II 真核转染试剂 | 1ml | 1300元 |
描述:Hifectin II是特殊修饰的聚乙烯亚胺(polyethylenimine)阳离子聚合物,与核酸结合形成复合物吸附于细胞膜表面后内吞入胞。在细胞内Hifectin II通过质子海绵效应缓冲内吞小体pH保护核酸免受降解,介导其转运板的同时或铺板后后立即转染,其卓越的in vitro和in v到胞浆胞核高效表达。Hifectin II允许有血清转染,在细胞铺ivo转染能力堪比jetPEI、Lipofectamine 2000、ExGen 500、FuGENE、SuperFect、Polyfect等转染试剂,而且在多数细胞或组织器官的表达更佳。
Hifectin II具有宽泛的细胞广谱性,高效转染的在细胞有A497, A549,BHK,Caco-2, C-26, C2C12, C3H/10T, CHO, COS1, COS7, Sf9, HeLa, HEK293, HT-29, MCF7, NIH3T3, Jurkat, K562, RAW264.7, THP1, U937, PC12, L929, 5HSY-5Y, Vero,原代神经元、原代肝细胞、皮肤成纤维细胞、脐静脉内皮细胞、人单核/巨噬细胞、牛和人血管内皮细胞、人胚胎干细胞等。Hifectin II具有优异的动物在体转染能力,介导基因在心肺肾肝脾等各种组织高效表达。
特征:
² 有血清转染,可在细胞铺板前后立即转染
² 媲美Lipofectamine 2000, jetPEI, FuGENE等,毒性低
² 高效转染siRNA、DNA、寡聚核苷酸
² in vitro转染细胞谱广,各种原代细胞和神经元
² in vivo动物转染,心肺肾肝脾等高效表达
质粒DNA质量:质粒高纯度OD260/280~1.8无内毒素。可用内毒素清除剂(#D1501)清除内毒素。
细胞准备:培养24h后,细胞胞体覆盖培养皿表面的50~90%时均可转染,但我们推荐较高细胞密度~80%转染为佳。原代细胞应控制在培养48h后细胞密度达到~80%时转染。细胞密度低时阳性转染率并不低但毒性可能较明显,而且因细胞总数少蛋白表达量不会很高。100%长满的细胞转化效率明显降低。如果表一或表二所列的volume of medium减半,且在转染4~8小时后换培养基,可进一步改善转染效率。细胞生长在10%血清培养基中,转染效果会更好。
Hifectin II具有卓越的转染能力,允许细胞在铺板时或铺板后立即加入混合好的Hifectin II-DNA转染混合物,效果与贴壁后转染相似,但节省时间,适合高通量筛选。
优化原则:不同类型的细胞对转染试剂和外源DNA的敏感性不同,同一细胞生长密度低时毒性会较明显。很多细胞按照列表推荐即可获得满意的结果,但一些细胞需要优化,目的是在无毒或低毒时获得最佳转染效率,且转染试剂和DNA用量最少。原则上,几乎所有转染试剂优化必须考虑的参数是N/P ratio,即转染试剂的正电荷基团可中和核酸的负电荷磷酸基团的摩尔比率。在DNA量固定时,提高N/P值意味着增加转染试剂的量,可增加转染效率,但也会逐渐增加细胞毒性。
优化操作:附表推荐的DNA量已经接近所列培养皿和细胞数的上限,一般无需增加。初次转染推荐N/P ratio=10 (附表灰色栏)。优化可在24孔板进行,可设定N/P ratio为5、6、7、8、9、10、11、12等,参考附表推荐的DNA量,按公式计算Hifectin II用量:
µl Hifectin II = 0.3 × NP ratio × µg DNA
以24孔板1 µg DNA为例,每增减1个N/P ratio意味着Hifectin II用量增减0.3 µl。siRNA和寡聚核苷酸的优化同上。
贴壁细胞转染 (#C1506,以24孔板为例,参见表一)
1. 稀释1µg DNA于100µl生理盐水(自备,勿用其它替代),混匀。
2. 取3.2µl Hifectin II加至DNA溶液(加样顺序勿相反,否则降低转染效率),立即振荡混匀,瞬时离心将液体甩至管底。
3. 室温放置15分钟。
4. 将100µl转染混合物直接加至1ml含10%血清的完全培养基中。倾斜转动培养板混匀。含血清培养基能提高转染效率。转染前无需更换培养基。培养基体积为转染混合物的10倍。
5. 培养24~48小时,检测基因表达,或1:10传代后加抗生素筛选。如果转染效率满意,转染后可不更换培养基,但因转染混合物稀释了培养基,也可转染4~8h后更换。
表一 Hifectin II贴壁细胞加样和优化表
|
Dilute DNA |
µl of Hifectin II |
volume of medium |
|||||
Culture Vessel |
Area cm2 |
Seeding Cells |
DNA µg |
Saline µl |
N/P=8 |
N/P=10 |
N/P=12 |
|
96-well |
0.3 |
1.5 ´ 104 |
0.25 |
20 |
0.6 |
0.75 |
0.9 |
0.2 ml |
48-well |
1 |
5 ´ 104 |
0.5 |
50 |
1.2 |
1.5 |
1.8 |
0.5 ml |
24-well |
2 |
1 ´ 105 |
1 |
100 |
2.4 |
3 |
3.6 |
1 ml |
12-well |
4 |
2 ´ 105 |
2 |
100 |
4.8 |
6 |
7.2 |
2 ml |
6-well 35-mm |
10 |
4 ´ 105 |
3 |
200 |
7.2 |
9 |
10.8 |
4 ml |
60-mm 25-cm2 |
28 |
8 ´ 105 |
5 |
400 |
12 |
15 |
18 |
8 ml |
100-mm 75-cm2 |
75 |
2 × 106 |
10-15 |
1000 |
24-36 |
30-45 |
36-54 |
15 ml |
注:传代巨噬细胞如RAW 264.7的DNA量参照表一加倍例如每一24孔用2µg DNA,设N/P ratio=10。但原代巨噬细胞DNA量参照表一减半,设定N/P ratio=8,按公式计算转染试剂用量:
µl Hifectin II = 0.3 × NP ratio × µg DNA
贴壁细胞在铺板时转染、或铺板后立即转染
操作要点是:(1)用含血清的完全培养基洗涤消化的细胞,以去除消化酶。(2)用含血清的培养基制备铺板用的细胞悬液,细胞量要稍大些,以转染后24h细胞长80~90%满,或转染后48h细胞完全长满为宜。(3)参照贴壁细胞转染步骤和表1制备Hifectin II-DNA转染混合物。(4a)铺板后立即转染:将细胞悬液加到培养皿中,然后立即加入Hifectin II-DNA转染混合物,混合均匀。或者(4b)铺板的同时转染:将Hifectin II-DNA转染混合物预先加到培养皿中,然后立即加入细胞悬液。(5)培养24~48小时检测基因表达。如果转染效率满意,转染后可不更换培养基,但因加入转染混合物导致培养基稀释,转染4~8h后更换培养基可使细胞生长更好。
悬浮细胞转染 (#C1505)
以24孔板Jurkat淋巴细胞、K562为例。按照表二准备细胞和DNA。初始转染推荐N/P=10,随后可根据转染效率或细胞毒性设置N/P=8、10、12优化,按公式计算相应Hifectin II的量。注意Daudi和Molt 4转染DNA的量参见表二适当再增加30%,然后按照N/P=10计算所需Hifectin II的量。
悬浮细胞转染:参见贴壁细胞转染方法制备转染试剂和DNA混合物,室温放置20分钟后直接加至1ml含10%血清培养基的细胞悬液中。培养24~48小时进行后续实验。
表二 Hifectin II悬浮细胞加样和优化表
|
Dilute DNA |
µl of Hifectin II |
volume of medium |
|||||
Culture Vessel |
Area cm2 |
Cell Numbers |
DNA µg |
Saline µl |
N/P=8 |
N/P=10 |
N/P=12 |
|
96-well |
0.3 |
3 ´ 104 |
0.3 |
20 |
0.72 |
0.9 |
1.08 |
0.2 ml |
48-well |
1 |
1 ´ 105 |
0.8 |
50 |
1.92 |
2.4 |
2.88 |
0.5 ml |
24-well |
2 |
2 ´ 105 |
1.5 |
100 |
3.6 |
4.5 |
5.4 |
1 ml |
12-well |
4 |
4 ´ 105 |
3 |
100 |
7.2 |
9 |
10.8 |
2 ml |
6-well 35-mm |
10 |
1 ´ 106 |
6 |
200 |
14.4 |
18 |
21.6 |
4 ml |
60-mm 25-cm2 |
28 |
2 ´ 106 |
10 |
400 |
24 |
30 |
36 |
8 ml |
100-mm 75-cm2 |
75 |
5 ´ 106 |
25 |
1000 |
60 |
75 |
90 |
15 ml |
注:计算公式 µl of Hifectin II = 0.3 × NP ratio × µg DNA
动物in vivo转染 (#C1505-1)
DNA、siRNA、寡聚核苷酸转染和优化相同。推荐初试转染N/P=10。按公式计算Hifectin II用量:
µl of Hifectin II = 0.02 × NP ratio × µg of DNA
表三 动物in vivo转染DNA和Hifectin II用量 (N/P=8)
µg, DNA |
1 |
5 |
10 |
20 |
30 |
50 |
60 |
70 |
100 |
µl, Hifectin II |
0.2 |
1 |
2 |
4 |
6 |
10 |
12 |
14 |
20 |
表四 动物in vivo转染参照表
|
注射部位 |
DNA |
Hifectin II |
注射体积 |
小鼠 |
尾静脉 |
50 (40-70) µg |
10 µl |
400 µl |
小鼠 |
腹腔 |
120 (100-200) µg |
24 µl |
1 ml |
小鼠 |
皮下 |
5 µg |
1 µl |
15 µl |
小鼠 |
脑 |
2.5 µg |
0.5 µl |
5 µl |
大鼠 |
静脉 |
160 (150-300) µg |
32 µl |
1-1.5 ml |
小鼠 |
脑 |
4 µg |
0.8 µl |
8 µl |
小鼠总量DNA在50-75µg之间较好,>50µg表达增加不明显但毒性增加,超过100µg部分动物可能死亡。注射混合物中DNA浓度应<0.5µg/ml。由于离子强度影响复合物形成,DNA和Hifectin II稀释于5%葡萄糖溶液的效果比稀释于生理盐水好。另外有研究认为小鼠静脉注射用400µl体积最佳。
1. 50µg DNA稀释于200µl 5%葡萄糖液(自备,勿用其它替代),振荡混匀。
2. 稀释8 µl Hifectin II于200µl 5%葡萄糖,振荡混匀。
3. 将稀释的Hifectin II加至DNA溶液(顺序勿反),立即振荡混匀。室温放置20分钟。
4. 动物注射。24~48小时左右处死观察。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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