组织细胞总谷胱甘肽检测试剂盒 E2015
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
E2015 |
组织细胞总谷胱甘肽检测试剂盒 |
100T | 560 |
描述:组织细胞总谷胱苷肽检测试剂盒(Total Glutathione Assay Kit)是一种灵敏简单的检测总谷胱甘肽的试剂盒。总谷胱甘肽包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH 是细胞中巯基的主要来源,对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用,动物细胞中GSH占总谷胱甘肽比例约90-95%。
原理:GSH可以和DTNB反应生成黄色的TNB和GSSG,利用该反应可以通过测定生成TNB的吸光度(A412nm)定量检测GSH;另外谷胱甘肽还原酶可以将GSSG还原为GSH,在反应体系中增加谷胱甘肽还原酶反应,可以测定总谷胱甘肽,并能通过酶反应将GSSG反复还原为GSH,从而极大提高GSH和DTNB显色反应对GSH检测的灵敏度。本试剂盒以GSH为标准品检测线性范围为1.25-40μM,灵敏度≤1.25μM。
适用:本试剂盒能够检测动物组织、培养细胞和多种其它生物样本中的总谷胱甘肽含量。
组成:
组份名称 |
规格 |
数量 |
总谷胱甘肽检测缓冲液 |
50ml/瓶 |
1 |
还原型谷胱甘肽(GSH) |
6mg/管 |
1 |
DTNB |
4mg/管 |
1 |
谷胱甘肽还原酶 |
150μl/管 |
1 |
NADPH |
5mg/管 |
1 |
蛋白去除试剂S |
0.5 g/管 |
1 |
组织细胞裂解液 |
100ml/瓶 |
1 |
DMSO |
1.2ml/管 |
1 |
储存条件:-20℃储存,12个月有效。NADPH配制成溶液后,可适当分装,-70℃储存。GSH和DTNB溶解后,-20℃储存。蛋白去除试剂S配制成溶液后4℃储存。
所需设备:酶标仪,最佳工作波长412nm
操作步骤:
1. 样品的准备
1.1 细胞样品的准备:收集新鲜细胞,PBS洗涤细胞一次,离心收集细胞,吸尽上清。加入
200 μl的预冷的组织细胞裂解液,冰浴匀浆或超声裂解细胞。4℃,10000g离心10分钟。取上清和蛋白沉淀试剂S溶液1:1混合并涡旋。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于总谷胱甘肽的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中总谷胱甘肽超出测定范围,可利用蛋白沉淀试剂S溶液适当稀释后测定,稀释倍数可达10-20倍。
1.2 组织样品的准备:利用含1mMEDTA的PBS灌流或漂洗组织,去除组织中的血液,然
后取约20mg组织,加入400μl的预冷的组织细胞裂解液,冰浴匀浆。4℃,10000g离心10分钟。取上清和蛋白沉淀试剂S溶液1:1混合并涡旋。4℃,10000g离心10分钟。取上清用于总谷胱甘肽的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中总谷胱甘肽超出测定范围,可利用蛋白沉淀试剂S溶液适当稀释后测定,稀释倍数可达10-20倍。
2. 试剂盒的准备
2.1 GSH储备液的配制:在本试剂盒提供的6mg GSH中加入1ml的纯水,溶解并混匀,即为GSH储备液,浓度为20mM。
2.2 DTNB储备液的配制:在本试剂盒提供的4mg DTNB中加入1ml本试剂盒提供的DMSO溶解并混匀,即为DTNB储备液,浓度为10mM。
2.3 NADPH储备液的配制:在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml纯水,溶解并混匀,即为NADPH储备液,浓度为5mg/ml。
2.4 总谷胱甘肽检测工作液的配制:根据待测样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液,表中试剂按比例混合后即为总谷胱甘肽检测工作液。
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1个样品 |
10个样品 |
50个样品 |
总谷胱甘肽检测缓冲液 |
150μl |
1.5ml |
7.5ml |
DTNB储备液 |
5μl |
50μl |
250μl |
谷胱甘肽还原酶 |
1μl |
10μl |
50μl |
2.5 NADPH工作液的配制:取NADPH储备液,利用总谷胱甘肽检测缓冲液稀释10倍,配制为0.5mg/ml的NADPH工作液。每检测一个样品需要50μl的0.5mg/ml NADPH。
3. 标准品的准备
将20mM的GSH储备液用蛋白去除试剂S溶液稀释成20、10、5、2.5、1.25、0.62μM浓度的GSH溶液,用于标准曲线测定。由于GSH在蛋白去除S溶液中不够稳定,每次测定需新鲜配制系列标准品稀释液。
4、测定方法
4.1 参考下表,使用96孔板,依次加入总谷胱甘肽检测工作液、样品或标准品后,混匀,25℃或室温孵育2分钟。
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空白对照 |
标准曲线 |
样品 |
总谷胱甘肽检测工作液 |
150 μl |
150 μl |
150 μl |
标准品 |
─ |
10 μl |
─ |
样品 |
─ |
─ |
10 μl |
蛋白沉淀试剂S溶液 |
10 μl |
─ |
─ |
25℃或室温孵育 |
2 min |
2 min |
2 min |
NADPH工作液 |
50 μl |
50 μl |
50 μl |
25℃孵育 |
20 min |
20 min |
20 in |
4.2 参考上表,各孔加入NADPH工作液50μl,25℃孵育20分钟。
4.3 各孔加入NADPH工作液50μl启动谷胱甘肽还原酶反应后,立即开始计时,并在5、10、20分钟等时间点测定A412nm。如果样品吸光度较低,可适当降低标准品浓度,延长反应时间进行样品测定。
5. 数据处理
利用GSH标准品浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用标准曲线和各样品的吸光度值计算样品的总谷胱甘肽浓度。由于有多个时间点的标曲,可以选择标曲线性最好的时间点计算样品总谷胱甘肽浓度。GSH标曲测定如下图所示:
参考文献
1.Akerboom, T.P., and Sies, H., 1981. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples. Methods Enzymol., 77, 373-382.
2. Nair, S. et al., 1991. Flow cytometric monitoring of glutathione content and anthracycline retention in tumor cells. Cytometry, 12, 336-342.
注意事项
1. 本试剂盒检测涉及氧化还原反应,很多氧化剂和还原剂都会干扰试剂盒的测定,特别是巯基乙醇、DTT等含有巯基的试剂会严重干扰本试剂盒的测定,请尽量避免。
2. 严格控制反应的温度和反应时间,并在每次测定同时利用标准品制作标准曲线,样品中谷胱甘肽浓度过低时,可适当延长反应时间。
3. NADPH在溶液中容易分解,要严格按储存条件保存。
4. 初次使用试剂盒时,粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。
5. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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