组织细胞谷胱甘肽还原酶检测试剂盒 E2013
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
E2013 | 组织细胞谷胱甘肽还原酶检测试剂盒 | 100T | 420 |
描述:谷胱苷肽还原酶检测试剂盒(Glutathione Reductase Assay Kit)是一种灵敏简单的利用比色法检测谷胱甘肽还原酶(GR)活性的试剂盒。谷胱甘肽包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH 是细胞中巯基的主要来源,对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用。GR广泛分布在各种组织细胞和体液中,可以还原GSSG生成GSH,维持细胞内或体液中充足的GSH。
原理:GR可以将GSSG还原为GSH,GSH可以和DTNB反应生成黄色的TNB和GSSG。在GSSG和DTNB相对过量的条件下,利用该反应可以通过测定生成TNB的吸光度(A412nm)定量检测GR活性。本试剂盒以GSH以TNB标准品和反应时间定量GR酶活性。检测线性范围为4.7-150mU/ml,灵敏度≤4.7mU/ml。
适用范围:本试剂盒能够检测培养细胞、实体动物组织等多种其它生物样本中的GR活性。
所需设备: 酶标仪,最佳工作波长412nm
组成:
组份名称 |
规格 |
数量 |
谷胱甘肽还原酶检测缓冲液 |
50ml/瓶 |
1 |
样品稀释液 |
50ml/瓶 |
1 |
DTNB |
4mg/管 |
1 |
TNB溶液(300μM) |
1 ml/管 |
1 |
氧化型谷胱甘肽(GSSG) |
12 mg/管 |
1 |
谷胱甘肽还原酶(GR) |
50μl/管 |
1 |
NADPH |
5 mg/管 |
1 |
组织细胞裂解液 |
100ml/瓶 |
1 |
DMSO |
1.2 ml/管 |
1 |
储存条件:-20℃储存,一年有效。NADPH配制成溶液后,可适当分装,-70℃储存。GSSG和DTNB溶解后,-20℃储存。
操作步骤:
1. 样品的准备
1.1 细胞样品的准备:收集新鲜细胞,PBS洗涤细胞一次,离心收集细胞,吸尽上清。加入
200 μl的Western及IP细胞裂解液裂解细胞,冰浴30分钟。4℃,10000g离心10分钟。取上清进行蛋白浓度定量后用于谷胱甘肽还原酶活性的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中谷胱甘肽还原酶活性超出测定范围,可利用谷胱甘肽还原酶检测缓冲液适当稀释后测定,稀释倍数请通过预实验确定。
1.2 组织样品的准备:利用含1mMEDTA的PBS灌流或漂洗组织,去除组织中的血液,然
后取组织样品约20 mg。加入Western及IP细胞裂解液400μl,冰浴匀浆。4℃,10000g离心10分钟。取上清进行蛋白浓度定量后用于谷胱甘肽还原酶活性的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中谷胱甘肽还原酶活性超出测定范围,可利用谷胱甘肽还原酶检测缓冲液适当稀释后测定,稀释倍数请通过预实验确定。
2. 试剂盒的准备
2.1 GSSG储备液的配制:在本试剂盒提供的12mg GSSG中加入1ml的纯水,溶解并混匀,即为GSSG储备液,浓度为10mM。
2.2 DTNB储备液的配制:在本试剂盒提供的4mg DTNB中加入1ml本试剂盒提供的DMSO溶解并混匀,即为DTNB储备液,浓度为10mM。
2.3 NADPH储备液的配制:在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml纯水,溶解并混匀,即为NADPH储备液,浓度为5mg/ml。
2.4 总谷胱甘肽检测工作液的配制:根据待测样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液,表中试剂按比例混合后即为总谷胱甘肽检测工作液。
|
1个样品 |
10个样品 |
50个样品 |
谷胱甘肽还原酶检测缓冲液 |
125μl |
1.25ml |
6.25ml |
GSSG储备液 |
10 μl |
100μl |
500μl |
DTNB储备液 |
5 μl |
50 μl |
250μl |
2.5 NADPH工作液的配制:取NADPH储备液,利用总谷胱甘肽检测缓冲液稀释10倍,配制为0.5mg/ml的NADPH工作液。每检测一个样品需要50μl的0.5mg/ml NADPH。
3. 标准品的准备
将300μM的TNB溶液用谷胱甘肽还原酶检测缓冲液稀释成150、75、37.5、18.8、9.4 μM浓度的TNB溶液,用于标准曲线测定。在本试剂盒相同反应体系下TNB标准曲线只需要测定1次,后续测定只需利用该标曲进行酶反应产物TNB生成量的计算。
4. 测定方法
4.1 TNB标准曲线测定:利用上述系列浓度TNB标准品,各取200μl到96孔板中,TNB各孔加入量分别为60、30、15、7.5、3.75、1.88、0nmol,测定A412nm。
4.2 参考下表,使用96孔板,依次加入谷胱甘肽还原酶检测工作液、样品后,混匀,25℃或室温孵育2分钟。
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空白对照 |
阳性对照 |
样品 |
谷胱甘肽还原酶检测工作液 |
140 μl |
140 μl |
140 μl |
谷胱甘肽还原酶 |
─ |
1μl |
─ |
样品 |
─ |
─ |
10 μl |
样品稀释液 |
11μl |
10 μl |
1μl |
25℃孵育 |
2 min |
2 min |
2 min |
NADPH工作液 |
50 μl |
50 μl |
50 μl |
25℃孵育 |
20 min |
20 min |
20 min |
4.3 各孔加入NADPH工作液50μl,25℃孵育20分钟。
4.4 孔加入NADPH工作液50μl启动谷胱甘肽还原酶反应后,立即开始计时,并在2.5、5、10、20分钟等时间点测定A412nm。如果样品吸光度升高过快,可适度稀释样品后测定;如果样品吸光度升高过慢,可适当延长反应时间进行样品测定。
5. 数据处理
利用TNB标准品的量为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用该标准曲线和各样品的吸光度值计算样品中一定时间段(注:计算酶活性的时间段最好采用5-15分钟时间段,这样可以避免样品本身的颜色及样品中较高浓度GSH和NADPH对反应的干扰)内产生的TNB量,从而换算为谷胱甘肽还原酶活力(注意精确计时)。对于细胞和组织样品,可以根据样品中蛋白浓度测定,计算每毫克蛋白中谷胱甘肽还原酶活力。由于有多个时间点的测定,可以选择时间线性良好的时间段计算谷胱甘肽还原酶活力。
谷胱甘肽还原酶定义:在25℃,PH 7.6条件下,每分钟还原1.0μmol GSSG为GSH的谷胱甘肽还原酶为1 U,1 U=1000 mU。
计算公式:酶活力(mU)=TNB生成量(nmol)/2/反应时间(min)。
参考文献
1. Foyer, C.H., Lelandais, M., and Kunert, K.J., 1994. Photooxidative stress in plants. Physiol. Plant. 92, 696-717.
2. Baillie, T.A. and Slatter, J.G., 1991. Glutathione: A vehicle for the transport of chemically reactive metabolites in vivo. Acc. Chem. Res. 24, 264-270.
注意事项
1. 本试剂盒检测涉及氧化还原反应,很多氧化剂和还原剂都会干扰试剂盒的测定,特别是巯基乙醇、DTT等含有巯基的试剂会严重干扰本试剂盒的测定;另外硫酸钠、硫酸铵和铁氰化物也会干扰本试剂盒的测定,请尽量避免。
2. 严格控制反应的温度和反应时间,样品中酶活性过低时,可适当延长反应时间。
3. TNB标准曲线只需测定1次即可,主要用于酶标板测定体系下校正吸光系数,传统文献报道的TNB吸光系数适用于分光光度计测定。
4. NADPH在溶液中容易分解,要严格按储存条件保存。
5. 初次使用试剂盒时,粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。
6. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
7. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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