液体样本谷胱甘肽还原酶检测试剂盒 E2003
货号 |
产品名称 |
规格 |
价格(元) |
E2003 |
液体样本谷胱甘肽还原酶检测试剂盒 |
100次 |
360 |
描述:液体样本谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(Glutathione Reductase Assay Kit)是一种灵敏简单的利用比色法检测谷胱甘肽还原酶(GR)活性的试剂盒。谷胱甘肽包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GSH 是细胞中巯基的主要来源,对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用。GR广泛分布在各种组织细胞和体液中,可以还原GSSG生成GSH,维持细胞内或体液中充足的GSH。本试剂盒以GSH以TNB标准品和反应时间定量GR酶活性。检测线性范围为4.7-150mU/ml,灵敏度≤4.7mU/ml。
规格:100次
储存: 按说明书要求保存 12个月有效
操作步骤:
1. 样品的准备
血浆样品或红细胞裂解液的准备:取新鲜抗凝血至少0.5ml,4℃,1000g离心5分钟,上清为血浆。对于沉淀中红细胞,利用冰冷PBS洗涤3次。取约5倍红细胞体积的冰冷的纯水,重悬细胞沉淀,冰浴10分钟。4℃,10000g离心10分钟。取上清进行蛋白浓度定量后用于谷胱甘肽还原酶的测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。如果样品中谷胱甘肽还原酶活性超出测定范围,可利用样品稀释液适当稀释后测定,稀释倍数请通过预实验确定。
2. 试剂盒的准备
2.1 GSSG储备液的配制:在本试剂盒提供的12mg GSSG中加入1ml的纯水,溶解并混匀即为GSSG储备液,浓度为10mM。
2.2 DTNB储备液的配制:在本试剂盒提供的4mg DTNB中加入1ml本试剂盒提供的DMSO溶解并混匀,即为DTNB储备液,浓度为10mM。
2.3 NADPH储备液的配制:在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml纯水,溶解并混匀,即为NADPH储备液,浓度为5mg/ml。
2.4 谷胱甘肽还原酶检测工作液的配制:根据待测样品数配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液,表中试剂按比例混合后即为谷胱甘肽还原酶检测工作液。
2.5 NADPH工作液的配制:取NADPH储备液,利用谷胱甘肽还原酶检测缓冲液稀释10倍,配制为0.5mg/ml的NADPH工作液。每检测一个样品需要50μl的0.5mg/ml NADPH。
3. 标准品的准备
将300μM的TNB溶液用谷胱甘肽还原酶检测缓冲液稀释成150、75、37.5、18.8、9.4 μM浓度的TNB溶液,用于标准曲线测定。在本试剂盒相同反应体系下TNB标准曲线只需要测定1次,后续测定只需利用该标曲进行酶反应产物TNB生成量的计算。
4. 测定方法
4.1 TNB标准曲线测定:利用上述系列浓度TNB标准品,各取200μl到96孔板中,TNB各孔加入量分别为60、30、15、7.5、3.75、1.88、0nmol,测定A412nm。
4.2 使用96孔板,依次加入谷胱甘肽还原酶检测工作液、样品后,混匀,25℃或室温孵育2分钟。
4.3 各孔加入NADPH工作液50μl,25℃孵育20分钟。
4.4 孔加入NADPH工作液50μl启动谷胱甘肽还原酶反应后,立即开始计时,并在2.5、5、10、20分钟等时间点测定A412nm。如果样品吸光度升高过快,可适度稀释样品后测定;如果样品吸光度升高过慢,可适当延长反应时间进行样品测定。
5. 数据处理
利用TNB标准品的量为横坐标,吸光度值为纵坐标制作标准曲线,并获得横纵坐标之间的函数关系式,然后利用该标准曲线和各样品的吸光度值计算样品中一定时间段(注:计算酶活性时间段最好采用5-15分钟时间段,这样可以避免样品本身的颜色及样品中较高浓度GSH和NADPH对反应的干扰)内产生的TNB量,从而换算为谷胱甘肽还原酶活力(注意精确计时)。由于有多个时间点的测定,可以选择时间线性良好的时间段计算谷胱甘肽还原酶活力。
谷胱甘肽还原酶定义:在25℃,pH 7.6条件下,每分钟还原1.0μmol GSSG为GSH的谷胱甘肽还原酶为1 U,1 U=1000 mU。
计算公式:酶活力(mU)=TNB生成量(nmol)/2/反应时间(min)。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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