组织细胞甘油酶法测定试剂盒 E1012
货号 | 产品名称 | 规格 | 目录价(元) |
E1012-50 | 组织细胞甘油酶法测定试剂盒 | 50次 | 660 |
E1012-105 | 组织细胞甘油酶法测定试剂盒 | 105次 | 960 |
描述:
甘油是 甘油三酯 的 水解 产物。 与游离脂肪酸一样,甘油含量是甘油三酯水解 反应 的可靠检测指标 ,但检测更加方便 。 本 试剂盒采用优化 步骤,能够检测实体组织、细胞中的甘油含量,线性范围为10---1200 μ mol/L 。
原理:
在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3-磷酸甘油, 再被甘油磷酸氧化酶氧化 产生过氧化氢;在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺,其光密 度值与甘油浓度成正比。
适用范围:
测定 实体 组织 、 细胞 中 的甘油浓度。
组成:
(105 次微板测定或 30 次 1 ml 比色杯测定):
(1) 裂解液 50 ml
(2) R1 试剂 16 ml
(3) R2 试剂 4 ml
(4) 4 m mol/L 甘油标准品 1 ml
4℃ 保存 6 个月 有效
所需设备:
酶标仪、生化分析仪 或 721 、 722 型可见光分光光度计 。最佳 工作波长 550 nm ,如无此波长建议优先选用 570nm 、次选 530 、 490nm 。
一 组织细胞裂解
细胞(包括分化的脂肪细胞) 裂解:
消化、离心收集细胞。或直接在培养皿内裂解。通常 6 孔板单孔约 2x10 6 个细胞, 75cm 2 瓶约 1x10 7
细胞。按比例每 1~2 x 10 6 细胞 加 0 .1ml 裂解液震荡或涡旋裂解后 ,静置 10 分钟。
动物组织裂解:
切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管精确称重,加入组织块后再称重,二者相减即减量称重法 计算组织重量 约 100mg) 。强烈建议按比例每 1mg 组织加10μl 裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。( 注意:裂解液用量在 1ml 或更多可保证有效的裂解与脂取)。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。(不推荐超声方法,因其不能完全和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量),而后,静置 10 分钟。
二 裂解液处理:
1. 取适量上清液转移到 1.5ml 离心管中 进行步骤 2 的操作。余下的裂解液可用BCA 法蛋白定量试剂盒 P1511 进行蛋白定量或-20℃ 储存。
2. 70℃ 加热 10 分钟灭活脂肪酶,可能出现絮状沉淀。
3. 室温 5000 rpm 离心 5 分钟 ,上层 清液 即可用于酶学测定。
三 工作溶液 配制:
按 4 :1 比例 取 4 ml 试剂 R1 与1 ml 试剂 R2 混合 即可, 立即使用或 4℃ 保存 <1 天,变色弃去 。 (注意:谨防来源不明但容易发生的甘油污染,可来自操作者本人或标准品液体微粒溅射等。)
四 标准 品稀释
用蒸馏水 生理盐水或与样品缓冲液一致的液体 ,将 4 mM 甘油标准品倍比稀释为1000 、 500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.25 、 15.625 、 7.8125μ mol/L 通常取其中 4~6 管即可,注意设置 0 浓度对照反应管 。
五甘油测定
1. 参见下表加样 。待测样品体积 10 μl ,多加可能会抑制反应。
2. 37℃或 25℃反应 10 分钟。 反应平衡后颜色在60 分钟 内稳定。
3. 先用蒸馏水 工作液的空白管调零,然后 测定各管OD 值 。
4. 绘制标准曲线并计算甘油浓度 。
附Excel 作图步骤 :各标准管 OD 值为 y 轴,标准 品 浓度为 x 轴 。 ( 鼠标左键圈住数据,点击做图向导,选择 散点图 --,点击 完成 。 ( 鼠标右键点图上 的某 一点,点击 添加趋势线 --,点击 选项 --,点击 显示公 式 和 R 2 值 。
5. 以每 mg 蛋白浓度或细胞数校正甘油含量。
加样表(可对样品和工作液比例进行微量调整)
说明:
1. 维生素C>0.18g/L、血红蛋白>2g/L、胆红素>0.25g/L、二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。
2. 红细胞糖酵解时合成磷酸甘油影响测定。
参考文献
1. Trinder, P. (1969). Ann Clin. Biochem. 6: 24 27.
2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 1
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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