凋亡DNALadder提取试剂盒 C1102
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格(元) |
C1102-25 | 凋亡DNALadder提取试剂盒 | 25次 | 400 |
C1102-50 | 凋亡DNALadder提取试剂盒 | 50次 | 700 |
描述:凋亡(apoptosis)细胞内出现凋亡小体,染色质断裂形成许多长度约为n x 180bp (n=1,2,3,4…)的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder,是细胞凋亡晚期无可争辩的特征。本试剂盒能够选择性地分离和提取凋亡组织细胞特有的DNA ladder,快速方便,无需有机抽提,检测灵敏度极高。可以从2000个凋亡细胞中检测到DNA ladder,实验灵敏度实际上只受限于DNA凝胶染色如溴化乙锭染色的灵敏度。推荐起始标本约1-10 x 105 个细胞,其中应含有至少1-2 x104个凋亡细胞;大于2 x104个凋亡细胞通常可以获得十分清晰的凋亡DNA ladder。据此,如果细胞凋亡发生率为10%,用户可用六孔板的一个孔(相当于一个35 mm培养皿)培养1-10 x 105个细胞,如果内含1-10 x 104个凋亡细胞,应足以获得清晰的凋亡DNA ladder。
本试剂盒既可用于从培养细胞中提取提取凋亡DNA ladder,也可用于组织。但与培养细胞相比,整体动物组织凋亡细胞出现的部位不定、规律性差,取材量和部位是否恰当,均显著影响最终DNA ladder的量。有丰富经验的用户可以使用本试剂盒从组织提取凋亡DNA ladder。
组成:溶液 A, B, C, D, E。
储存:分别将各组分储存于4 ºC或-20 ºC。
适用:从细胞或组织块中提取凋亡DNA Ladder。25/50 assays。
提取步骤:
自备10%SDS,95-100% ethanol。1-10 x 105个正常细胞,含有至少约1-2 x104、最好有大于2 x104凋亡细胞。
1. PBS洗涤细胞。微型离心机5000 rpm 4ºC 5 min收集细胞。弃上清吸除管壁附着液体。
2. 按比例每1-10 x 105个细胞加入100 ml 溶液A,冰上10 min。振荡30秒。5000 rpm 4 ºC离心10分钟。勿触动管底沉淀,将上清液转移到新离心管。
3. 加入10ml 自备的10% SDS于上清液,至终浓度为1%。
4. 加入2 ml 溶液B,混匀。37 ºC 1小时。可延长至2小时。
5. 加入2 ml 溶液C,混匀。37 ºC 2小时。可延长至4小时。
6. 加入1 ml 溶液D,混匀。
7. 加10 ml (1/10 vol.) 溶液E,加250ml (~2.5 vol.)乙醇,混匀。-20 ºC孵育30分钟。
8. 12000rpm 4C离心10min。弃上清,尽量吸除管壁附着液体。敞开管口,室温干燥沉淀。
9. 用17ml双蒸水溶解沉淀,加3 ml 6 x DNA凝胶上样缓冲液,震荡。如沉淀不溶可用枪头捣碎,50-90 ºC加热10min然后高速离心。取全部20ml上清上样1% agarose gel电泳。溴化乙锭染色紫外观察。
说明:
1. 灵敏度实际上只受限于DNA凝胶染色如溴化乙锭染色灵敏度。采用高质量、较薄的琼脂糖凝胶和窄小的加样孔,或用更敏感的凝胶DNA荧光检测方法有助于增加DNA条带观察的灵敏度。
2. 必须注意只有晚期或严重的凋亡细胞才有ladder。由于本试剂盒仅特异提取凋亡DNA ladder,如果凝胶上没有出现DNA ladder通常表明细胞没有发生凋亡,或者有凋亡发生但尚未出现DNA断裂,此时增加细胞用量也难以凑效。本试剂盒可以从1000个凋亡细胞中检测到凋亡DNA ladder,例如从大于3 x106个细胞获得清楚的凋亡DNA ladder,至少需要1%凋亡细胞。
3. 组织块提取。10 mg组织块放入小玻璃匀浆器,加200 ml溶液A,上下手动匀浆15-20次。取出匀浆液,冰上10 min。振荡10秒。5000 rpm 10分钟收集上清液并转移到新离心管。执行步骤3。
4. 步骤2吸取管底的沉淀,将导致凋亡DNA ladder中出现高分子量DNA。
按比例增加加样量时,溶液D无须按比例多加;1 ml 溶液D可适宜于1-5倍现有的比例。
部分发表论文:
1 Huang Qiaojia, Lan Fenghua, Zheng Zhiyong, Xie Feilai, Han Junyong, Dong Lihong, Xie Yanchuan, Zheng Feng, 2011. Akt2 Kinase Suppresses Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (GAPDH)-mediated Apoptosis in Ovarian Cancer Cells via Phosphorylating GAPDH at Threonine 237 and Decreasing Its Nuclear Translocation. The Journal of Biological Chemistry, 286(49): 42211-42220.
2 Wei Ning, Liu Geng-Tao, Chen Xiao-Guang, Liu Qian, Wang Feng-Peng, Sun Hua, 2011. H1, a derivative of Tetrandrine, exerts anti-MDR activity by initiating intrinsic apoptosis pathway and inhibiting the activation of Erk1/2 and Akt1/2. Biochemical Pharmacology, 82(11): 1593-1603.
3 Liu Xiao Dong, Sun Hua, Liu Geng Tao, 2010. 5-Bromotetrandrine enhances the sensitivity of doxorubicin-induced apoptosis in intrinsic resistant human hepatic cancer Bel7402 cells. Cancer Letters, 292(1): 24-31.
4 Liu Xiao-shan, Jiang Jikai, Jiao Xiao-yang, Wu Ying-e, Lin Jing-hua, Cai Ying-mu, 2009. Lycorine induces apoptosis and down-regulation of Mcl-1 in human leukemia cells. Cancer Letters, 274(1): 16-24.
5 Song Jun-Qiu, Teng Xu, Cai Yan, Tang Chao-Shu, Qi Yong-Fen, 2009. Activation of Akt/GSK-3β signaling pathway is involved in intermedin1-53 protection against myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion. Apoptosis, 14(9): 1061-106
6 Hou Yan, Wei Huailing, Luo Yuan, Liu Gengtao, 2010. Modulating expression of brain heat shock proteins by estrogen in ovariectomized mice model of aging. Experimental Gerontology, 45(5): 323-330.
7 Bao Xiu Qi, Liu Geng Tao, 2008. Bicyclol: a novel antihepatitis drug with hepatic heat shock protein 27/70-inducing activity and cytoprotective effects in mice. Cell Stress and Chaperones, 13(3): 347-355.
8 Huang Li-heng, Hu Jia-qi, Tao Wei-qun, Li Yuan-hong, Li Guan-ming, Xie Pei-yi, Liu Xiao-shan, Jiang Jikai, 2010. Gossypol inhibits phosphorylation of Bcl-2 in human leukemia HL-60 cells. European Journal of Pharmacology, 645(1-3): 9-13.
9 Zhang Qiang, Zhao Xin-Huai, Wang Zhu-Jun, 2008. Flavones and flavonols exert cytotoxic effects on a human oesophageal adenocarcinoma cell line (OE33) by causing G2/M arrest and inducing apoptosis. Food and Chemical Toxicology, 46(6): 2042-2053.
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