内毒素清除剂 (Endotoxin Removal Reagent) D1501
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
D1501 | 内毒素清除剂 (Endotoxin Removal Reagent) | 200次 | 230元 |
描述:内毒素(endotoxin)的化学本质为脂多糖(lipopolysaccharides),是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分。脂多糖共价连接到非极性的疏水性类脂A(lipid A)形成带负电荷的大分子,同时还具有一个亲水性的寡糖核,因而具有疏水和亲水双重性质。制备质粒DNA和重组蛋白时,细菌破壁之后将释放大量脂多糖。无论是普通制备纯化程序,还是离子交换、凝胶排阻过滤、甚至是氯化铯超速离心等高级制备程序,脂多糖将不可避免地与DNA或蛋白质牢固结合而被共同纯化。脂多糖具有强烈的免疫活性和细胞毒性,并能产生多种复杂的细胞生物学效应,大多数情况下会明显干扰并产生不可预测的实验结果。例如在DNA转染实验中,内毒素竞争性干扰转染试剂与DNA的结合,显著降低转染效率,并产生明显细胞毒性, 降低外源基因表达水平。在体转染时, 与DNA结合的内毒素无疑是主要的致热原1。DNA、蛋白质或其它样品中内毒素污染,无论是对原代和传代细胞还是整体动物均具有显著的毒性作用。
内毒素清除剂能与DNA、重组蛋白以及液体样品中的内毒素特异结合。在特定pH、盐浓度、温度条件下,经过室温12000 rpm离心,DNA或蛋白质等保留在水相,内毒素被浓缩到极小体积的下层相而被清除,从而达到清除内毒素效果。经过3次重复抽提可将活性为5,000~50,000 EU/ml的内毒素水平降低到5~0.5 EU/ml以下,即降低1,000~10,000倍。
适用:清除DNA、RNA、蛋白质或其他液体样品中的内毒素。
组成:内毒素清除剂 20 ml,200 次清除。可清除总计100 ml 体积的DNA、蛋白质溶液。
储存:4 ºC储存1个月,-20 ºC长期储存。
自备试剂:无内毒素的高纯水,沉淀DNA用的3M 醋酸钠,TE缓冲液,异丙醇或乙醇,内毒素检测试剂。
使用方法:提取前内毒素清除剂放在冰上15分钟,期间翻转瓶子数次使液体均匀冰冷。预冷内毒素清除剂、按照推荐的温度操作绝对重要。可按比例加大或缩小提取规模。
1. a). 已纯化的质粒DNA内毒素清除:吸取500 mLDNA溶液于微型离心管,加入1/10 体积3M 醋酸钠或1/20体积5M 氯化钠溶液。冰水浴5分钟。
b). 在提取质粒时清除内毒素:以碱裂解法质粒提取为例,在加入裂解和中和溶液并离心去除碎片之后,吸取含DNA的上清溶液于新离心管,冰水浴5分钟。
2. 加1/5 体积100 mL预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,冰浴或4oC 10分钟。溶液应清亮。
3. 37°C水浴,不时振荡数次每次30秒。然后37°C孵育20-30 min或直到溶液分为两相。
4. 12,000 rpm离心5 min,30°C。离心温度必须至少大于25°C以上。
5. 溶液必须分为两相,否则应重复步骤3-4。上层水相含DNA,下层油状相含内毒素。
6. 将含DNA的上层水相转移到新管,弃去油状相。重复抽提2次,即重复步骤2-6两次。
7. 最后加2体积的乙醇或者0.6体积的异丙醇,与DNA上清液混合。-20°C 30 min 或过夜。12,000 rpm 4°C离心10 min,弃上清。加入70%乙醇洗涤沉淀,12,000 rpm 4°C离心5 min弃上清。空气干燥沉淀。加入100~200 ml 无内毒素的高纯水或缓冲液溶解沉淀。
8. 用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性,并与初始样品比较。
说明:
1. DNA浓度>1mg/ml 时清除内毒素效率降低。由于DNA和蛋白质本身的性质,清除程序可导致10-20% DNA丢失,所幸的是与清除内毒素的艰难相比DNA更容易提取制备。
2. 所有溶液应用无内毒素的高纯水配制。所有器械材料均应不含内毒素。玻璃器皿可高温烘烤,非挥发性水溶液可高压120 °C高温处理。
3. 步骤2~6可用于清除蛋白质、其它溶液、水中的内毒素。蛋白丢失约为10%左右,其中疏水性蛋白丢失稍多
参考文献:1. Cotton, M., et al. Gene Ther. 1, 239, (1994)
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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