植物RNA快速提取试剂盒 R1052
货号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
R1052-50 | 植物RNA快速提取试剂盒 | 50次 | 400元 |
R1052-100 | 植物RNA快速提取试剂盒 | 100次 | 680元 |
描述:Plant RNAtrip是一种单相RNA快速提取试剂盒,可高效裂解坚固的植物细胞并强烈抑制RNA酶活性。细胞破碎之后,植物多糖立即被Plant RNAtrip独特的成分结合。离心抽提步骤将RNA与灭活的RNA酶、蛋白、基因组DNA污染分离,并清除植物多糖多酚以及次生代谢产物。在RNA沉淀之前加入Plant RNA Aid清除植物多酚,并清除残余的多糖。提取可在60分钟内完成,所提取的RNA纯度极高,不含DNA和多糖和多酚污染,可用于构建cDNA文库、RT-PCR、Northern转印分析、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译、和RNA酶保护实验。适于各种植物组织RNA提取,也特别适合富含糖原的动物肝脏和肌肉组织提取高纯度RNA。如果植物组织富含多酚和次生代谢产物,推荐使用Plant RNA Extraction kit (R1050)。
组成 (100次提取):
(1) Plant RNAtrip: 100 ml,用于植物组织裂解、分离RNA、结合植物多糖和多酚;
(2) Plant RNA Aid: 5 ml, 用于进一步去除植物多酚和多糖和次级代谢产物。
适用范围:
适用于各种植物组织。每1 ml Plant RNAtrip试剂可裂解200 mg新鲜或冻存植物组织或5-10 ´ 106个培养细胞。也特别适用于富含糖原的动物肝脏肌肉组织。
储存条件: 4°C密封避光保存
效期:1年
用户实验用品和操作准备:
极微量的RNA酶都会导致RNA降解。分离RNA时RNA酶污染主要来自以下五个方面:(1) 实验人员的双手。(2) 器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。我们的Step by Step质量监测表明,Plant RNAtrip可强烈抑制RNA酶活性并在分离步骤清除RNA酶。因此在有Plant RNAtrip存在的步骤,使用高压消毒20分钟的吸头离心管和溶液即可胜任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后,来自实验材料的RNA酶污染将会导致RNA降解,因此应严格使用高压灭活RNA酶的用品。戴手套无疑是有益的。只要严格按照本指南进行准备和操作,使用Plant RNAtrip总是能获得高纯度RNA。
1. 固体组织破碎设备。可用下列装置之一:1)玻璃匀浆器。泡酸清洁,用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨,清洗方法同玻璃匀浆器。3)高速机械匀浆器(Polytron,Tekmar或类似产品),打开开关,在蒸馏水中清洗分散器头数次。
2. 高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀溶解之后,应严格使用高压消毒的一次性用品。然而Plant RNAtrip能在RNA酶污染环境下工作,在裂解步骤可使用未高压但洁净的一次性吸头和离心管,但仅推荐在紧急情况下这样做。
3. 普通双蒸水,高压消毒20分钟。用于冲洗器皿,配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v,室温过夜,高压消毒30分钟。用于溶解RNA,配制TE缓冲液和75%乙醇。
4. 湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。
5. 其它用品。电泳槽,双蒸水冲洗。离心机和加样器,无需处理。
6. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA如使用极大量RNA酶,为防污染,须全面仔细清洗实验器具和实验区域。
RNA提取程序:
1. 植物组织细胞破碎与裂解
冰上操作。立即并快速破碎组织至关重要。初始组织细胞过量不仅使RNA得率下降,还将导致DNA和蛋白质污染。
1.1.植物组织破碎与裂解
确定组织用量:推荐按比例每50-200 mg新鲜植物组织加1 ml Plant RNAtrip,但植物组织用量的上限变化甚大。(1)某些新鲜植物组织含水量甚高,而较干燥的植物组织50mg可能已经接近上限。为获足量RNA必须测试加入每种组织的量。注意使用过量的组织将导致提取失败。 (2) 软组织、叶片、花、多汁组织、发芽种子等可直接加入Plant RNA Reagent研磨破碎,而坚硬的植物组织如种子、木质茎干等最好先在液氮中研磨破碎为粉末。
按比例每50-200 mg植物组织加1 ml Plant RNAtrip,按下列方法之一裂解组织。(1) 研钵:适用于液氮冻存组织。将液氮冻存组织研成粉末,加1 ml Plant RNAtrip,继续研磨组织至完全破碎也可转移到玻璃匀浆器继续研磨。(2) 玻璃匀浆器:放入剪碎的新鲜植物组织,加入1 ml Plant RNAtrip,放置冰上,上下手动匀浆组织10-20次。(3) 内切式高速机械匀浆器:将植物组织放入塑料或玻璃试管内,试管置冰浴烧杯中,加入1 ml Plant RNAtrip,将内切式分散器头插入管内溶液中间并与组织块接触,转速12,000-20,000 rpm,缓慢上下移动试管10-20次,直到大部分组织打散。注意:少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA提取。用研钵和玻璃匀浆器匀浆组织时应略微多加一些裂解液以补充裂解产物粘在器皿壁上造成的体积丢失。破碎组织用玻璃匀浆器可能比液氮研磨方便。
1.2.植物培养细胞的破碎与裂解
弃培养基,收集细胞。每5-10 ´ 106个细胞加1 ml Plant RNAtrip,须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上10分钟,倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。
2 将裂解产物转移到1.5 ml离心管,置冰上20分钟。注意:富含多糖和多酚的植物组织可延长孵育时间至30-60分钟。
3 12,000 ´ g 4°C 离心10分钟。取离心后的上清液,转移到新管。注意:组织纤维碎片、植物多糖、多酚沉淀在管底。大部分基因组DNA也在管底形成疏松粘稠的团状物。取上清液时如吸入少量拉丝状DNA粘稠物,不影响后续实验。
4 加入0.2 ml氯仿,充分颠倒混匀,冰上孵育5分钟。
5 12,000 ´ g,4°C离心10分钟,溶液分为两相。RNA在上层水相,下层为有机相,两相界面为一层薄膜。吸出0.5 ml上层水相转移到新离心管。注意:取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相,以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入,应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟,再次吸取水相。这一点至关重要,违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。
6 加入上清液1/10体积(~50ml) 的Plant RNA Aid到上清液,混匀,冰上孵育15分钟以进一步结合植物多酚和多糖,溶液将会变浑浊。离心12,000 ´ g 4°C 10分钟。小心吸出上层水相转移到新离心管,勿扰动和吸入下面的透明胶冻状多酚和多糖沉淀。注意:完全去除植物多糖至关重要,否则将明显降低RNA回收率,并使沉淀呈难溶解的胶冻状。
7 将步骤5或6获得的上清约500-600ml转移到新管,加入等体积异丙醇,混匀。冰育5-10分钟已足以沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀仅在组织极少时有用。
8 10,000 ´ g,4°C 离心10分钟。管底可见少许RNA沉淀。注意:如初始组织细胞量少,RNA将附着在管壁,用肉眼几乎难辨沉淀,但不影响实验。如RNA 沉淀量很多并呈胶冻状,通常表明有多糖、多酚和蛋白污染。应仔细检查操作步骤。一个补救措施是用Plant RNAtrip溶解沉淀,从步骤2开始重新抽提沉淀。
9 弃上清。立即加入1 ml 75%乙醇,颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000 ´ g离心5分钟。弃上清,尽量完全吸去管壁上的液体。注意:乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮,勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4°C保存一周或在-20°C保存一年。
10 敞开管口空气干燥5-10分钟使残留液体挥发,RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自备的DEPC处理的高压消毒纯水溶解沉淀。RNA溶液可保存于-70°C或液氮中。注意:过分干燥将使RNA难以溶解。55°C加热或反复冻融数次可以助溶。RNA溶液加3倍体积乙醇冻存于-20°C,用时离心沉淀。
说明
1.测定OD值,根据OD260计算RNA浓度。OD260/280比值可初步判断RNA质量,比值在1.6-2.0之间均属正常。起始组织量过大,或吸取了有机相或碎片,将使RNA样品中蛋白和杂质含量高,RNA沉淀乙醇洗涤不充分(步骤8),均可导致OD260/280比值降低。但切记OD260/280比值还受很多非质量因素的影响。例如,RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低,用TE或离子强度较高的溶液溶解时较高,但均不影响RNA后续使用。切记即便是已降解的RNA,OD260/280比值也能达到看似完美的2.0左右,因此该比值并非判断RNA降解与否最佳的指标。判断RNA质量的最佳途径是进行普通RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性。
2. 检查RNA完整性。取1 mg RNA样品,加5ml 纯水加1ml上样缓冲液进行1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色,紫外灯观察。
3. 检查RNA完整性。取1 mg RNA样品,加5ml 纯水加1ml上样缓冲液,进行1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色,紫外灯观察。
4. Plant RNAtrip试剂勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤,立即用大量水清洗。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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