细胞核提取试剂盒 P1202
货号 | 产品名称 | 规格 | 目录价(元) |
P1202-50 | 细胞核提取试剂盒 | 50次 | 380 |
P1202-100 | 细胞核提取试剂盒 | 100次 | 660 |
描述:在破碎组织细胞时加入活化剂,帮助裂解细胞,反复振荡或使用剪切力释放细胞核,然后在温和条
件下低速离心收集细胞核。在30-60分钟内完成,无需特殊设备,简便易行,重复性好。适用于从组织块、
贴壁或悬浮培养细胞制备完整高纯度细胞核。制备的细胞核仍然保持其在细胞内时所具有的形状和大小,
是进行细胞核相关实验、研究蛋白核转位、DNA-蛋白相互作用、以及进行WBt和免疫共沉淀的理想材料。
组成:100 ml Buffer 1(CER), 5 ml Reagent A, 100 ml Buffer 2(NER), for 100 preparations。
储存:短期4 ºC。可分装出一部分−20 ºC保存。
适用:从组织块、贴壁或悬浮培养细胞制备完整的细胞核。
Step-1A 培养细胞裂解
1. 贴壁细胞需消化或刮下细胞,悬浮细胞可直接离心,PBS 洗涤,800 × g 5 min 收集细胞。计数,并估
计细胞沉淀的体积。每次提取需要1-2 107 个细胞。通常每1 × 107 个细胞的沉淀体积约100 μl。
2. 加入10 倍于细胞沉淀体积的1 ml 冰预冷的Buffer 1(CER),振荡重悬细胞。冰水浴5 分钟。
3. 加入1/20 体积约50 μl Reagent A,剧烈振荡混合。冰水浴5 分钟。再次剧烈振荡。
4. 将细胞裂解物3 次或多次通过22 号针头剪切,或用小容积间隙紧密的玻璃匀浆器上下研磨20 次。在
相差显微镜下检查游离的核应达到95% 而未裂解细胞应少于5%。否则继续剪切或研磨。
Step 1-B 组织块破碎和裂解
1. 称取100-200 mg 新鲜组织如肝脏、脑,PBS 冲洗,加入1 ml(约10 倍组织体积)冰预冷的Buffer 1
(CER)。
2. 用间隙严密的研杵上下研磨培养上下研磨组织10 次。冰水浴5 分钟。
3. 加入1/20 体积约50 μl Reagent A,混合。冰水浴5 分钟。剧烈振荡。
4. 在相差显微镜下检查游离的核应达到95% 而未裂解细胞应少于5%,否则继续剪切或研磨。
5. 如有必要,用滤纸过滤组织匀浆裂解物。
Step 2 细胞核制备
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。1000 × g 离心3 min 4 ºC 沉淀细胞核,弃上清。
2. 用10 倍于胞核体积(~0.5 ml) Buffer 2( NER) 重悬核。2000 × g 离心10 min at 4 ºC,弃上清。
3. 重复步骤2 洗涤细胞核。在相差显微镜下胞核应游离分散在清亮背景下存在颗粒物质表明细胞质成分
残留;核聚集表明存在粘连性的细胞骨架或染色质,通常由于细胞匀浆破碎不足或起始细胞数太多。
4. 弃上清。用50-100 μl 适宜的缓冲液重悬细胞核,进行下一步实验。或将胞核沉淀直接− 70 ºC 保存,
注意解冻后会有部分核在融化过程中破裂。
注意:
1. 破碎细胞是关键环节。与组织块相比,培养细胞特别是贴壁细胞较难破壁。组织细胞裂解物3 次或多
次通过22 号针头剪切破碎细胞,或用小容积玻璃匀浆器、间隙紧密的研杵上下研磨培养20 次。用相
差显微镜检查未裂解细胞应少于5%。否则继续剪切或研磨。
2. 基于梯度密度离心原理,以离心力g 计算正确的离心速度十分重要。
3. 加入何种缓冲液重悬细胞核,取决于用户后续的实验。如做WB 可用RIPA 裂解缓冲液。
4. 进行Western Blot 和2D-胶电泳,可先用小体积的水重悬核沉淀,然后加入样品缓冲液,如果直接用
含SDS 的缓冲液裂解核将释放大量粘稠的DNA 使样品难以分散。反复加热变性有助于DNA 断裂,
可通过细针头反复抽吸打断DNA。免疫沉淀时可直接加入IP 缓冲液。
蛋白研究:蛋白提取、蛋白定量、Western Blot…核酸研究:核酸提取、PCR、核酸电泳… 抗体:单克隆抗体、多克隆抗体、酶标抗体… 细胞生物学:转染试剂、生化测定、细胞培养…
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